厌氧培养箱的操作规程

（一）操作室厌氧环境形成：
1. 按使用要求放置好必要的附件和器具;
2. 通电源开照明灯，开温控仪，调节所需温度;
3. 操作室内放入1000g钯粒（封闭）和500g干燥剂，并放入美兰指示纸（封闭）;
4. 关紧取样室内外门，并抽真空校验;
5. 操作室内第一次置换（氮气置换）：
A. 把乳胶手套套在观察板法兰圈上并扎紧
B. 接通氮气进气路，打开氮气控制阀1，使手套鼓起，关闭阀门1，然后扎紧袋口;
6. 操作室第二次置换（氮气置换）重复一次充氮过程，取样室先抽真空，并注意随时用脚踏开关开闭排气。如此连续三次氮气置换。
7. 操作室第四次置换（混合气体置换）：
（混合气体配比为N2 85%、H2 10%、CO2 5%）
A. 调换气路打开混合气阀3进气，充气时取样室先抽真空，并随时用脚踏开关开闭排气;
B. 关掉混合气体阀3，并打开阀5，使混合气体经过流量计，调整流量计，流量为每分钟10ml左右;
C. 混合气体重复2-3次转换，经过上述过程，基本形成厌氧环境。
8. 操作室内打开粑粒除氧剂，接通除氧催化器电源进行催化除氧，一小时后打开美兰指示纸观察其变况，不变色为操作室内达到厌氧环境;
9. 开紫外线灭菌灯，室内进行灭菌处理，灭菌时间按具体实验自定。
（二）菌种的置入和培养：
1. 检查取样室内门并关紧;
2. 打开取样室外门，将菌种放入取样室后即关上外门;
3. 取样室充氮置换三次过程：打开真空泵，先抽真空度500ml汞柱（66kPa）以上停，然后人工打开氮气阀2进气，使指针回复零位，关掉阀2。第二次重复操作一次。第三次操作时，使真空度500ml汞柱（66kPa）以上停，然后打开阀4进混合气，使指针回复零位，关掉阀4。取样室充氮置换三次过程结束;
4. 如选定真空度较低就需要增加置换的次数;
5. 取样室外门开启、关紧，再抽低真空度100ml汞柱（13kPa）检验;
6. 厌氧培养箱需要长期连续使用的条件：
A. 每天在操作室内打开美兰指示纸观察，如不正常就必须重新换气;
B. 要长期连续输入微量的混合气体，使补进的氮气能和微量的氧结合通过催化吸收，保证室内厌氧状态，补入混合气流量选定为每分钟10ml左右;
C. 连续培养运行一天，更换一次除氧剂和干燥剂。
D. 操作室内温度可任意选择和控制。
7. 混合气瓶、氮气瓶输出压力调整：调节减压阀，使输出压力0.1Mpa左右。

厌氧培养箱的使用注意事项

1.仪器尽可能地安装于空气清净、温度变化较小的地方;
2.开机前应全面熟悉和了解各组成配套仪器、仪表的使用说明，掌握正确使用方法;
3.培养物放入必须是在操作室内达到绝对厌氧环境后放入;
4.如发生故障（停气等原因）操作室内仍可保持10小时厌氧状态（超过10小时则根据需要把培养物取出另作处理）;
5.经常注意气路有无漏气现象;
6.调换气瓶时，注意要扎紧气管，避免流入含氧气体。
7. 真空泵按要求使用，定期检查加油。

厌氧菌培养方法

厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
　　1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
　　2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。
　　3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）即厌氧培养箱，是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。

    4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。
    5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细?菌生长用。我没见过。
    6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤?纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细?菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反应后耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽孢杆菌。
    7.疱肉培养基：本身就是一个不需特殊设备的厌氧培养法。疱肉和肉?汤装入大试?管，液面封凡士林，造成无氧环境。